孤独症谱系理论：自闭症谱系障碍儿童早期筛查外周血生物学标记物研究

来 源：中国学校卫生2022年6月第43卷 第6期

作 者：张瑜1,2,卢红艳1,唐炜1,王秋霞1

1.江苏大学附属医院儿科，镇江212000;2.江苏大学第四附属医院儿科

【摘要】 目的 研究淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）家族（总 ｓＡＰＰ、ｓＡＰＰ?α、ｓＡＰＰ?β）、脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）及 γ－氨基丁酸 （ＧＡＢＡ）在自闭症谱系障碍与正常儿童外周血水平差异，探讨自闭症早期筛查的生物学标记及其与自闭症严重程度的相关性。 方法 选取 ２０１９ 年 １—１２ 月在江苏大学附属医院被诊断为自闭症的 ４１ 名儿童为自闭症组，以同期在该院体检生长发育正常的 ４１ 名健康儿童为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测两组儿童血清总 ｓＡＰＰ、ｓＡＰＰ?α、ｓＡＰＰ?β、ＢＤＮＦ 及ＧＡＢＡ 水平。 结果 自闭症组儿童血清总 ｓＡＰＰ，ｓＡＰＰ?α 水平（２ １３２．９８±３３３．２８ ｎｇ ／ ｍＬ，３３５．１１±３３．８７ ｐｇ ／ ｍＬ）高于对照组（１ ７３４．７６±３５７．９７ ｎｇ ／ ｍＬ，２７４．８４±３２．１２ ｐｇ ／ ｍＬ），ＧＡＢＡ 水平（４．１７±０．９５ μｍｏｌ ／ Ｌ）低于对照组（６．３５±０．８４ μｍｏｌ ／ Ｌ），差异均

有统计学意义（ｔ 值分别为 ３．９２，４．２５，－７．２７，Ｐ 值均＜０．０５）；且 ＧＡＢＡ 在重度自闭症患儿外周血水平（３．４８±０．７７ μｍｏｌ ／ Ｌ）低于轻－中度患儿（４．９４±０．９８ μｍｏｌ ／ Ｌ），差异有统计学意义（ ｔ ＝ －３．３１，Ｐ＜０．０５）；ＲＯＣ 曲线显示，总 ｓＡＰＰ（ＡＵＣ 为 ０．７７，９５％ＣＩ ＝ ０．６６～ ０．８７）、ｓＡＰＰ?α（ＡＵＣ 为 ０．７７，９５％ＣＩ ＝ ０．６７～ ０．８７）及 ＧＡＢＡ（ＡＵＣ 为 ０．９５，９５％ＣＩ ＝ ０．９０ ～ ０．９３）具有一定的诊断效能（Ｐ 值均＜０．０５），其中 ＧＡＢＡ 曲线下面积最大（０．９５），其检测灵敏度（８５．６５％）及特异性（８０．７６％）最高。 二元 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 回归分析显示，ｓＡＰＰ?α（ＯＲ＝ １．０４，９５％ＣＩ ＝ １．００～ １．０７）及 ＧＡＢＡ（ＯＲ ＝ ０．０２，９５％ＣＩ ＝ ０．００ ～ ０．３２）表达水平异常是自闭症发生的相关因素（Ｐ 值均＜０．０５）。 结论 外周血总 ｓＡＰＰ、ｓＡＰＰ?α 及 ＧＡＢＡ 表达水平在自闭症儿童具有特异性，可以作为疾病筛查的生物学指标，其中 ＧＡＢＡ 敏感度及特异度最高。

【关键词】 孤独性障碍；早期诊断；生物学标记；回归分析；儿童

自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)是一组起病于婴幼儿期的神经行为发育障碍，在全世界患病率逐年增高，且预后不佳，超过一半的自闭症患儿成年后不能独立生活[1],若能早发现、早干预，预后则明显改善。目前早期诊断多依靠行为学核心症状标准，而等到症状达典型诊断标准干预常为时已晚。国内外已有报道[2-5],外周血淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)家族（总sAPP、sAPP?

1对象与方法

1.1对象

选取2019年1—12月在江苏大学附属医院就诊的41名自闭症儿童为自闭症组，由两名儿科专业高级职称临床医师根据《精神障碍诊断和统计手册》治疗。以同期在本院体检且生长发育正常的41名健康儿童为对照组。自闭症组儿童年龄3~12岁，平均年龄(7.42±2.15)岁，其中女童13名，男童28名；对照组儿童年龄3~14岁，平均(7.83±3.47)岁，其中女童20名，男童21名。两组儿童均出生居住于本地，在年龄、性别、体重上差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。受试儿童排除标准：既往有脑器质性疾病或神经系统疾病史及精神、心理、遗传因素等导致的各种神经精神障碍，以及合并有自闭症的其他疾病（如Rett综合征、Asperger综合征、脆性X染色体综合征），且两组儿童无直接亲属关系。本研究已通过江苏大学附属医院伦理委员会审批（编号：SWYXLL20200429-4),由入组儿童家长签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1儿童自闭症谱系障碍评定量表(ChildhoodAu?环境变化的适应、焦虑反应等共15项内容，采用1~4分评价，总分60分。总分为30~36分者评定为轻－中度自闭症患儿，37~60分者评定为重度自闭症患儿[7]。量表为患儿父亲或母亲当面回答后由医师填写，填写完整后统一保存。本研究量表的Cronbachα系数为0.81,问卷信、效度良好。GABA水平检测采用酶联免疫吸附试(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测，所有入组儿童抽取清晨空腹静血3mL,2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝，3000r离心10min,离心半径15cm,分离血清，-80℃冰箱保存。标本全部收集齐后，采用ＥＬＩＳＡ 法测定总 ｓＡＰＰ、ｓＡＰＰ?α、ｓＡＰＰ?β、ＢＤＮＦ 及 ＧＡ?ＢＡ 水平，试剂盒购自中国 Ｓｉｎｏｂｅｓｔｂｉｏ 公司，根据试剂盒标准步骤操作。

1.3统计学方法

应用SPSS22.0软件进行数据处理与统计学分析，对符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组样本之间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布计量资料[M(P25,P75)]表示，两组间比作出ROC曲线。应用二元Logistic回归分析自闭症发生的高危因素，并计算比值比(OR值）及95%可信区间(95%CI),检验水准α=0.05。

2结果

2.1自闭症组及对照组儿童外周血sAPP蛋白家族、GABA及BDNF水平比较与对照组儿童比较，自闭症组儿童外周血总sAPP及sAPP?α水平显著增高，均<0.05);两组之间sAPP?β及BDNF表达水平差异均无统计学意义。

2.2轻－中度及重度自闭症儿童外周血sAPP蛋白家族、ＢＤＮＦ、ＧＡＢＡ 水平比较 自闭症组内重度与轻－中度儿童外周血中总 ｓＡＰＰ、 ｓＡＰＰ?α、 ｓＡＰＰ?β 及 ＢＤＮＦ水平之间差异无统计学意义（Ｐ 值均＞０．０５），ＧＡＢＡ 水平差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。 。

2.3诊断效能分析由图1所示，血清总sAPP、sAPP?α、sAPP?β、BDNF及GABA诊断自闭症的ROC曲线所示，曲线下面积(AUC)均大于0.5,其中总sAPP、sAPP?α及GABA具有一定的诊断效能(P值均<0.05),对应的截断值分别为1762.00ng/mL、288.00pg/mL、5.19μmol/L。

2.4儿童自闭症发生相关因素的Logistic回归分析以是否发生自闭症为因变量（是=1,否=0),以血清总sAPP、sAPP?α、sAPP?β、BDNF及GABA水平为自变量，进行二元 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 回归分析发现，ｓＡＰＰ?α 及 ＧＡＢＡ表达水平异常是自闭症发生的相关因素。

3讨论

对自闭症的诊断及严重程度进行评估，目前使用最广泛的是儿童自闭症评定量表，此外还有自闭症诊断访谈量表、自闭症诊断观察量表等，上述量表评估结果难以避免受到主观因素的影响。因此，需要寻找一些效能更高的客观指标为协助自闭症诊断提供参考。

APP基因是伴随着家族早老性痴呆相关的错义突变的识别而被发现的。APP通过β和Υ分泌酶的序贯作用裂解成具有神经毒性的β-淀粉样肽(Aβ),此为淀粉样途径；另外APP还可通过α分泌酶裂解生成具有神经营养作用的分泌型APP?α(sAPP?α),α分泌酶在Aβ序列内部裂解APP,阻断了Aβ的生成，此为非淀粉样途径[8]。Bailey等[2]曾检测25名2~4岁自闭症儿童及25名匹配的健康儿童血浆sAPP?α水在儿童早期通过检测sAPP?α水平识别一些自闭症患儿。一篇Meta分析总结了22篇高质量、双盲、安慰剂对照药物治疗自闭症的研究，发现用于治疗阿尔茨海默病的药物美金刚（减少Aβ沉积）及加兰他敏（增加了sAPP?α的释放）可明显改善自闭症的核心症状，提高患儿语言表达及社会互动、注意力等能力，减少易怒、多动及情绪不稳[9]。以上研究表明，sAPP及其分解产物可能在自闭症的发病中起重要作用，甚至可能与其核心症状有关。既往多项研究表明，早期自闭症患儿存在头围过度生长现象[10-11],被认为可能与sAPP?α促进患儿大脑合成代谢有关[1]。本研究结果闭症的血清学指标。重度与轻－中度自闭症儿童血浆APP蛋白家族之间水平差异无统计学意义，提示APP蛋白家族可能对自闭症严重程度判断无特异性。

BDNF是一种重要的神经元营养因子，能促进神经元生长、发育和存活，参与突触间神经递质的传递和突触重建，并能调节学习、记忆、应激及心情等[1]。Philippe等[12]利用传递不平衡检验及同胞分析法对38个儿童自闭症高发家庭进行研究，未发现BDNF基因与儿童自闭症有明显关联。而李家鑫等[13]对68名自闭症患儿BDNF水平及BDNF基因rs6265进行检测，发现自闭症组BDNF水平明显高于对照组，轻中度与重度患儿的等位基因及基因型分布存在差异，提示自闭症与BDNFrs6265基因相关，并影响了BDNF表达。本次研究未发现BDNF在两组儿童血清中表达水平存在差异，且重度与轻－中度自闭症儿童血浆中BD?NF水平差异无统计学意义，需要进一步研究。GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，有保护认知的功能。已有研究者在ASD小鼠模型中观察到γ-氨基丁酸能中间神经元障碍[14],还有学者发现正常小鼠通过光遗传学抑制内侧前额叶皮层的γ-氨基丁酸能中间神经元使其出现认知功能缺陷[15]。本研究中自闭症组儿童GABA水平明显低于对照组儿童，可能与γ-氨基丁酸能中间神经元功能障BA可能是评价病情轻重的血液标记物之一。

诊断效能分析显示，总sAPP、sAPP?α、sAPP?β、断效能，其中总sAPP≥1762.00ng/mL,sAPP?α≥288.00pg/mL,GABA≤5.19μmol/L,可高风险提ASD的诊断。GABA检测灵敏度为85.65%,特异度为80.76%,高于其他几项检测指标，提示GABA在自闭症诊断中效能更显著。Logistic回归分析发现，sAPP?α及GABA表达水平异常是自闭症发生的相关因素，亦提示sAPP?α及GABA对自闭症发生具有潜在预测价值。

综上所述，本研究通过对自闭症与正常儿童的外周血相关标记物对照研究，认为血清总sAPP、sAPP?α及GABA可能是自闭症的早期生物学标记物，其中GABA有望成为诊断效能较高，且能识别病情严重性的特异性标记物，为将来创建一个结合血清标记物及临床症候群的新的自闭症诊断标准提供依据。本研究仍存在一些不足之处，目前认为自闭症谱系障碍的发病主要由先天遗传因素及环境因素共同作用导致，本次研究的人口学信息仅做了患儿年龄、性别、体重调查，还可增加父母健康状况、母亲受孕年龄、是否早产、母乳喂养及出生时是否窒息等因素，并增加社会环境因素的调查，如患儿居住环境、父母性格及学历、家庭收入等。在今后的研究中，将进一步扩大样本量，全面考虑上述因素及患儿的起病过程、病情轻重程度、有无并发症等进行分层研究，寻找出疾病不同阶段的特异性生物学标记物。

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