孤独症谱系理论：5- HT转运体基因多态性与孤独症核心家系的关联研究

来 源：中国心理卫生杂志　2004年　第18卷　第5期

作 者：邬素萍　贾美香　阮燕　双梅　公晓红　张彦波　杨建中　凌焱苏　刘靖　郭延庆　杨晓玲　张岱①

北京大学精神卫生研究所　(100083)

【摘　要】目的:探讨中国汉族人群5- HT转运体基因多态性(HTTSNP18)与孤独症的关系。方法:应用聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性(PCR- RFLP)分析方法对175个孤独症核心家系测定基因型和等位基因。结果:孤独症患儿与父母的基因频率和基因型频率的分布呈基本一致的趋势。传递不平衡检验(TDT)显示等位基因传递无统计学意义,(McNemarχ 2= 0.00, P> 0.05)。结论:本研究未发现5- HT转运体基因多态性(HTTSNP18)与孤独症存在关联,提示该基因多态性不影响孤独症的易感性,在中国汉族孤独症发病中不起主要作用。

【关键词】 　儿童精神病学　孤独症　5- HT转运体基因　传递不平衡检验　多态性　限制性片断长度

Family- based Association Study of the serotonin transporter Gene Polymorphism and Autism in the Chinese trios

WUSuping, Jia Meixing, Ruan Yan et al. Institute of Mental Health, Peking University, 100083

【Abstract】 Objective: To investigate the association between the serotonin transporter gene polymorphism HTTSNP18and autism.Methods: The serotonin transporter gene polymorphism HTTSNP18was tested by PCR- RFLP in 175 Chineseautism family trios. Results: The polymorphism had no significant evidence for preferential transmission of an allele by thetransmission disequilibrium test(TDT)(χ 2= 0.00, P> 0.05).Conclusion: There was likely no association between thepolymorphism at the serotonin transporter gene and autism. The serotonin transporter gene polymorphism might not play acausal role in the development of autism.

【 Key Words】 　 autism　 serotonin transportergene　transmission disequilibrium test　 polymorphism　 restriction fragment length polymorphism

孤独症(Autism)是一种严重的神经发育障碍。该病临床表现以社会交往障碍、兴趣与活动内容局限、刻板和重复为特征。一般均发病于婴幼儿期,少数患儿5- 6岁时症状才明显,男孩发病可数倍于女孩。由于此症起病年龄早,症状奇特,预后不良而引起学者们的广泛关注。虽然研究涉及许多领域,但是孤独症的病因及发病机制尚不清楚。其中,遗传因素在其发病中起到重要作用的观点已得到国际研究界的公认。家系和双生子研究表明,孤独症是一种具有显著遗传的神经精神障碍[1,2]。由于5- HT转运体基因的功能和在基因组中的位置,它被认为是一个重要的孤独症候选基因。最近Kim等[3]报道, 5- HT转运体基因上的单核苷酸多态性HTTSNP18与孤独症存在显著的关联。为了探讨中国汉族人群中, 5- HT转运体基因在孤独症易感性的作用,笔者对175个孤独症核心家系进行5- HT转运体基因HTTSNP18多态性的关联研究。

对象和方法

对象

所有研究对象为2001年至2003年就诊于北京大学精神卫生研究所门诊和北京儿童孤独症康复协会在外地收集的孤独症患者,共有孤独症核心家系175例(每例含有血缘父母双亲和一个患者),均为汉族。所有患者均符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM- Ⅵ)[4]中孤独症的诊断标准,同时除外脆性X综合征、已确诊有染色体异常或其他怀疑与孤独症有关的神经疾病。175例中男164例,女11例,年龄2～ 17岁,平均6± 3岁。所有患者的父母均签署了知情同意书,研究得到了北京大学医学部伦理委员会的批准。

方法

1.基因组DNA的提取　所有研究对象均抽取外周静脉血5ml,枸橼酸抗凝,采用常规酚-氯仿方法提取基因组DNA。

2.HTTSNP18基因型检测用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR- RFLP)分析方法检测所有研究对象的基因型。PCR反应的引物为:上游引物5' - CTGCCTAGGAGGAGCAAAAGTCA- 3',下游引物

5' - GATTTTCCCTAATTTTCCCTGCTG- 3'。PCR扩增在ABI 2700型热循环仪上进行。PCR产物的长度为296 bp。25μl的反应体系如下: 10mM Tris- HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mMMgCl2, 0.001%(w v)gela-tin, 200μM dNTP,引物各0.4μM, 1.0单位Taq DNA聚合酶和40ng基因组DNA。PCR扩增反应条件:95℃预变性5min,循环条件为95℃ 30s, 58℃ 40s,72℃ 40s,共32个循环,最后72℃延伸7min。取15μlPCR产物置于5μl酶及酶切缓冲液体系中(含5单位的内切酶HpaⅡ), 37℃酶切过夜,用2%琼脂糖电泳读取基因型。

3.统计学处理:分别计算基因型和等位基因频率,进行Hardy- Weinberg(H- W)定律的吻合度检验。采用统计分析软件包(Statistical Packages forsocialsciences, release 10.0, SPSS 10.0)进行数据管理和统计分析。在含有父亲、母亲和患病子女的核心家系中应用传递不平衡检验(the transmission disequilibriumtest, TDT)[5]来分析等位基因与孤独症的关联。

结果

1.基因型分布和等位基因频率见表1。患儿与其父母的基因频率和基因型频率的分布呈基本一致的趋势,经χ 2的吻合度检验显示基因型分布符合H- W平衡法则。

表1　HTTSNP18的基因型分布和等位基因频率基因型等位基因频率GG GA AA G A

患者141(0.81) 30(0.17) 4(0.02) 312(0.89) 38(0.11)

双亲272(0.78) 75(0.21) 3(0.01) 619(0.88) 81(0.12)

注:括号内数据为频率(%)

2.HTTSNP18的酶切电泳图:

注: 1, 8为296bp杂合子, 2为190bp纯合子, 3-7, 9为106bp纯合子。

3.TDT分析:根据父母基因型在患病子女中传递情况,在175个家系中进行TDT检验。TDT分析显示HTTSNP18的等位基因传递无统计学意义(P> 0.05)(见表2)。

表2　等位基因的传递不平衡检验

传递的等位基因未传递的等位基因χ 2 P G A

G 275 36 0.000 1.000

A 36 3

讨论

孤独症是一种遗传异质性疾病,至今病因不明。大量证据表明5- HT调节脑发育的多个方面,包括细胞的分化,神经的向外生长和突触的产生。另外,5- HT转运体抑制剂在减少刻板和重复行为方面作用显著[6- 11]。5- HT转运体(serotonin transporter)对于调节脑的5- HT能神经递质和外周的5- HT的活动起着重要作用。30- 50%孤独症患者及其一级亲属色氨酸水平升高[12- 15]。2001年一个基因组扫描发现5- HT转运体基因的多点最大LOD值(MMLS)为2.34,单点最大LOD值(MMLS)为3.6[16]。这些证据提示该基因是一个重要的孤独症候选基因。本研究用5- HT转运体基因HTTSNP18多态性作为遗传标记,对于中国汉族人群中的孤独症患者进行关联研究,采用以家系为基础的传递不平衡检验(TDT)来探讨HTTSNP18多态性与孤独症的关系。结果未能发现该位点与孤独症的关联关系,从而提示HTTSNP18多态性不是孤独症的易感位点。尽管基因的功能分析提示该基因参与孤独症的发病过程,但本研究结果表明这个位点并不增加患孤独症的风险,可初步排除这个多态性位点与中国汉族孤独症的关系。这一结果与Kim等的研究不一致。造成我们之间研究结果的差异可能在于: 1.Kim等的研究样本相对较小(115个家系),而我们的样本为175个家系; 2. Kim等的样本由多个种族组成(白种人,美洲人,亚裔美国人,西班牙人),而我们的样本均由汉族组成。孤独症是一种遗传异质性的复杂的多基因疾病,也就是说5- HT转运体基因对白种人的发病起作用,而对汉族人起很小的作用或不起作用,因此,来自不同地区,不同种族的研究难以产生一致的结果。遗传异质性可能是我们之间研究结果差异的主要原因。本研究未能发现5- HT转运体基因HTTSNP18多态性与孤独症存在关联,在中国汉族孤独症的发病中可能不起主要作用。虽然TDT结果为阴性,但是我们并不能除外5- HT转运体基因在孤独症易感性的微小作用。因此,对于5- HT转运体基因及其邻近区域的基因需进一步的研究以确定其易感性。

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